1. Příprava roztoků

     Kineticko-spektrofotometrické stanovení askorbové kyseliny

• Zásobní roztok askorbové kyseliny o koncentraci 70 mg/100 ml byl připraven rozpuštěním navážky ve 100 ml vody. Byl připravován vždy čerstvý.
• Zásobní roztok HCl o koncentraci 4 mol/l byl připraven zředěním ~ 37% HCl. Přesná koncentrace byla určena alkalimetrickou titrací roztokem NaOH standardizovaným na C₂H₂O₄.2H₂O.
• Zásobní roztok methyloranže o koncentraci 125 mg/l byl připraven rozpuštěním příslušné navážky 125 mg v 1000 ml destilované vody.
• Zásobní pracovní roztok methyloranže v HCl byl připraven smícháním 27,3 ml zásobního roztoku 4 mol/l HCl a 25 ml zásobního roztoku methyloranže o c_m = 125 mg/l a doplněním do 250 ml destilovanou vodou.
• Zásobní pracovní roztok KBrO₃ o koncentraci 1,44.10^–3 mol/l byl připraven rozpuštěním příslušné navážky 0,2405 g KBrO₃ v destilované vodě a doplněním na objem 1000 ml. Byl přechováván v zábrusové láhvi.

     Jodometrické stanovení askorbové kyseliny (potenciometricky)

• Zásobní roztok askorbové kyseliny o koncentraci 70 mg/100 ml byl připraven rozpuštěním navážky ve 100 ml vody. Byl připravován vždy čerstvý.
• Zásobní roztok odměrného roztoku I₂ – 1,441 g I₂ s 4 g KI doplněno vodou do 1000 ml. Roztok byl přechováván v tmavé zábrusové láhvi při laboratorní teplotě. (1 ml I₂ odpovídá 1 ml askorbové kyseliny).
• Škrob – 0,4% roztok škrobu byl připraven tak, že 1 g škrobu byl rozpuštěn v 250 ml vody a byl zahřát k varu. Po ochlazení byl přechováván v zábrusové láhvi při laboratorní teplotě.

2. Příprava vzorků

     Vzorek I
Čistá kyselina askorbová ve vodě, koncentrace 77,7 mg/100 ml.
Tento roztok byl 10x zředěn pro obě metody stanovení.

     Vzorek II
Nápoj „Toma jablko“.
Záruční doba do 08-06-2003, otevřeno a měřeno 21-08-2002.
Deklarovaná koncentrace askorbové kyseliny byla 12 mg/100 ml a více.

     Kineticko-spektrofotometrické stanovení askorbové kyseliny
Bylo rozpuštěno 15 ml nápoje do 50 ml odměrné baňky a doplněno po značku vodou.

     Jodometrické stanovení askorbové kyseliny
Pro titrační metodu nebylo ředěno.

     Vzorek III
Roztok připravený z tablety Vitamin C, šumivé tablety citrónová příchuť“.
Záruční doba 28-01-2004, otevřeno 19-07-2002 a měřeno 21-08-2002.
Deklarovaný obsah askorbové kyseliny byl 60 mg askorbové kyseliny na 1 tabletu.

     Jedna tableta byla rozpuštěna vodou do odměrné baňky na 50 ml. Tento roztok byl 10x zředěn pro obě metody stanovení.

     Vzorek IV
Roztok připravený z tablety Vitamin C, šumivé tablety orange“.
Záruční doba 28-02-2004, otevřeno 26-08-2002 a měřeno 26-08-2002.
Deklarovaný obsah askorbové kyseliny byl 60 mg askorbové kyseliny na 1 tabletu.

     Jedna tableta byla rozpuštěna vodou do odměrné baňky na 50 ml. Tento roztok byl 10x zředěn pro obě metody stanovení.

3. Postupy práce

3.1. Stanovení přesnosti a opakovatelnosti pipetování

     Vybranou kádinku, do které byla vypouštěna destilovaná voda z vybrané pipety nebo mikropipety, jsme položili na váhu a vytárovali. Do jiné kádinky jsme nalili destilovanou vodu a odtud napipetujeme destilovanou vodu do vytárované kádinky, zvážíme a zapíšeme hmotnost. Opět vytáruje a potom vypustíme další pipetovaný objem a opět zvážíme. Tak to provedeme s každou pipetou (mikropipetou) 10x.

     Stanovení opakovatelnosti bylo prováděno:

• 1) pro dělenou pipetu o objemu 2 ml (pipetováno 1,6 ml)
• 2) pro mikropipetu o objemu 200 µl, tj. 0,2 ml (pipetováno 200 µl).

3.2. Kineticko-spektrofotometrické stanovení askorbové kyseliny

     Závislosti na teplotě
Do kyvety bylo napipetováno 1,6 ml zásobního pracovního roztoku methyloranže v HCl a 0,2 ml 10x zředěného zásobního roztoku askorbové kyseliny. Kyveta byla umístěna do držáku kyvet spektrofotometru. Potom bylo automatickou mikropipetou přidáno 200 µl 1,44.10^–3 mol/l KBrO₃ a špičkou pipety byl výsledný roztok promíchán (celková doba operace 5 sekund). Ihned po té byla po 15 sekundách měřena absorbance (510 nm) až do odbarvení roztoku.

     Měření byla prováděna pro 3 oblasti teplot (pro každou oblast 3x):
1) 12 ^oC (10,9; 12,4; 13,5)
2) 22 ^oC (21,7; 21,8; 22,7)
3) 31 ^oC (30,0; 30,0; 32,0)

     Závislosti na koncentraci HCl
Do kyvety bylo napipetováno 1,6 ml roztoku methyloranže v HCl (o různé koncentraci HCl – viz níže) a 0,2 ml 10x zředěného zásobního roztoku askorbové kyseliny. Kyveta byla umístěna do držáku kyvet spektrofotometru. Potom bylo automatickou mikropipetou přidáno 200 µl 1,44.10^–3 mol/l KBrO₃ a špičkou pipety byl výsledný roztok promíchán (celková doba operace 5 sekund). Ihned po té byla po 15 sekundách měřena absorbance (510 nm) až do odbarvení roztoku.

     Roztoky methyloranže v HCl o různé koncentraci HCl byly připraveny následujícím způsobem:
Do 7 odměrných baněk o objemu 25 ml bylo pipetováno vždy 2,5 ml zásobního roztoku methyloranže o koncentraci 125 mg/l a postupně 2,00 ml; 2,25 ml; 2,50 ml; 2,75 ml; 3,50 ml; 4,00 ml; 4,25 ml zásobního roztoku 4 mol/l HCl a doplněno destilovanou vodou po rysku. Pro každou koncentraci HCl byly prováděny 3 paralelní měření.

     Závislosti na koncentraci methyloranže
Do kyvety bylo napipetováno 1,6 ml roztoku methyloranže (o různé koncentraci – viz níže) v HCl a 0,2 ml 10x zředěného zásobního roztoku askorbové kyseliny. Kyveta byla umístěna do držáku kyvet spektrofotometru. Potom bylo automatickou mikropipetou přidáno 200 µl 1,44.10^–3 mol/l KBrO₃ a špičkou pipety byl výsledný roztok promíchán (celková doba operace 5 sekund). Ihned po té byla po 15 sekundách měřena absorbance (510 nm) až do odbarvení roztoku.

     Roztoky methyloranže v HCl o různé koncentraci methyloranže byly připraveny následujícím způsobem:
Do 7 odměrných baněk o objemu 25 ml bylo pipetováno vždy 2,73 ml zásobního roztoku 4 M HCl a postupně 1,0 ml; 1,5 ml; 2,0 ml; 2,5 ml; 3,0 ml; 3,5 ml a 4,0 ml zásobního roztoku methyloranže o koncentraci 125 mg/l a doplněno destilovanou vodou po rysku. Pro každou koncentraci methyloranže byly prováděny 3 paralelní měření.

     Závislosti na koncentraci KBrO₃
Do kyvety bylo napipetováno 1,6 ml zásobního pracovního roztoku methyloranže v HCl a 0,2 ml 10x zředěného zásobního roztoku askorbové kyseliny. Kyveta byla umístěna do držáku kyvet spektrofotometru. Potom bylo automatickou mikropipetou přidáno 200 µl KBrO₃ (o různé koncentraci – viz níže) a špičkou pipety byl výsledný roztok promíchán (celková doba operace 5 sekund). Ihned po té byla po 15 sekundách měřena absorbance (510 nm) až do odbarvení roztoku.

     Měření byla prováděna pro 5 hladin koncentrací KBrO₃ (pro každou hladinu 3x):
1) 5,76.10^–4 mol/l
2) 1,44.10^–3 mol/l
3) 2,88.10^–3 mol/l
4) 5,76.10^–3 mol/l
5) 1,44.10^–2 mol/l.

     Kalibrační závislosti
Ze zásobního roztoku askorbové kyseliny byly připraveny kalibrační roztoky tak, aby výsledné koncentrace askorbové kyseliny se pohybovaly v rozsahu koncentrací 0,701–30,9 mg/100 ml. Do kyvety bylo napipetováno 1,6 ml zásobního pracovního roztoku methyloranže v HCl a 0,2 ml příslušného předředěného kalibračního roztoku askorbové kyseliny. Kyveta byla umístěna do držáku kyvet spektrofotometru. Potom bylo automatickou mikropipetou přidáno 200 µl 1,44.10^–3 mol/l KBrO₃ a špičkou pipety byl výsledný roztok promíchán (celková doba operace 5 sekund). Ihned po té byla po 15 sekundách měřena absorbance (510 nm) až do odbarvení roztoku.

     Tento postup byl opakován pro každý z 23 kalibračních roztoků.

     Praktické analýzy
Vzorek byl rozpuštěn v destilované vodě a předředěn na přibližnou výslednou koncentraci askorbové kyseliny 5–10 mg/100 ml. Do kyvety bylo napipetováno 1,6 ml zásobního pracovního roztoku methyloranže v HCl a 0,2 ml vzorku. Kyveta byla umístěna do držáku kyvet spektrofotometru. Potom bylo automatickou mikropipetou přidáno 200 µl 1,44.10^–3 mol/l KBrO₃ a špičkou pipety byl výsledný roztok promíchán (celková doba operace 5 sekund). Ihned po té byla po 15 sekundách měřena absorbance (510 nm) až do odbarvení roztoku.

     Každý vzorek byl měřen paralelně 3x.

     Čištění kyvet
Kyvety byly po každém měření propláchnuty nejprve destilovanou vodou, potom ethanolem a ponechány vyschnout.

     Vyhodnocení
Naměřené hodnoty absorbancí pro každé měření byly přeneseny do programu Excel a byl vytisknut graf závislosti absorbance na čase. Indukční perioda byla stanovena jako průsečík přímkových závislostí částí I a II grafu (viz [9]).

     Koncentrace askorbové kyseliny byla pak v programu Excel vypočtena z kalibrační rovnice (viz [9]).

     Poznámka:
Pro ověření výsledků stanovení pomocí kineticko-spektrofotometrické metody nezávislou metodou byla vybrána titrační metoda jodometrického stanovení askorbové kyseliny s potenciometrickou indikací bodu ekvivalence [9].

3.3. Jodometrické stanovení askorbové kyseliny (potenciometricky)

     Do kádinky s míchadélkem byl odpipetován příslušně zředěný roztok vzorku, kádinka byla postavena na míchačku a do roztoku byla ponořena OR elektroda tak, aby byla celá ponořena v roztoku. Nebylo-li tomu tak, bylo přidáno 10 ml destilované vody. Po zapnutí míchání byl roztok titrován přídavky odměrného roztoku I₂. Po každém přídavku byla odečtena hodnota E (mV). Potenciometrická titrace byla prováděna vždy paralelně 3x.

     Vyhodnocení potenciometrické titrační křivky bylo provedeno jednak graficky, jednak metodou první a druhé derivační křivky (viz [9]).