Příprava mAb proti rekombinantí formě OspC Borrelia burgdorferi sensu lato
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2013 |
| Druh | Konferenční abstrakty |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Popis | Lymeská borrelióza je multisystémové bakteriální onemocnění, jehož původcem je bakterie Borrelia burgdorferi sensu lato (Bbsl). Mezi hlavní fyziologické rysy této spirochety patří bohatá antigenní výbava, která jí umožňuje adaptaci na široké spektrum hostitelů. Jedním z hlavních antigenů je lipoprotein OspC. Exprese OspC je indukována v první fázi sání klíštěte a je nezbytný po transmisi spirochet do obratlovčího hostitele. Jedná se tedy o jeden z prvních antigenů, na který imunitní systém reaguje a aktivně vytváří protektivní protilátky. Vznikající protilátky jsou ovšem schopné plně vázat jen specifický fylogenetický typ OspC, který jejich tvorbu vyvolal. Cílem naší práce bylo navrhnou, připravit a purifikovat rekombinantní formu OspC relevantní pro území České republiky a připravit sadu myších monoklonálních protilátek (mAb) schopných vázat přirozený antigen jednoho nebo více kmenů Bbsl a mohl by tak být základem pro imunologické testy s vysokou specifitou pro naše území. Námi navržený rekombinantní OspC (OspCEX) vychází z kmene B. afzelii BRZ42 izolovaného z klíštěte získaného při teréních sběrech v Brně - Pisárkách. Gen ospC byl pomocí specifických primerů upraven tak, aby počátek čtecího rámce začínal na kodonu odpovídajícím 35. aminokyselině OspC (kyselina asparagová) včetně signální sekvence, respektive 14. aminokyselině nativní formy OspC. Prvních 13 aminokyselin bylo odštěpeno z důvodu zvýšení rozpustnosti navrhovaného proteinu. Konzervovaná C-koncová oblast byla v rekombinantním OspC zachována. Konstrukt byl zaklonován do expresního vektroku pET M60 UbIII, nesoucí histidinovou kotvičku, gen pro ubiquitin a specifickou sekvenci pro hydrolýzu TEV proteázou. Syntetizovaný protein byl purifikován pomocí afinitní chromatografie, hydrolyzován TEV proteázou a repurifikován. Výsledná zkrácená verze BA_BRZ42_OspCEX o čistotě 98% byla použita pro imunizaci myší za účelem izolace monoklonálních protilátek. Z testovaných hybridomů bylo vybráno 9 linií, které se liší ve schopnosti vázat přirozené celobuněčné antigeny (B. burgdorferi sensu sticto, B. afzeli a B. garini) i rekombinantní zkrácené varianty těchto proteinu a to buď v roztoku (ELISA) nebo v denaturované podobě (Western-blot), popřípadě v kombinaci s různou afinitou k testovaným antigenům. |