Quantification of proteins by means of spectrophotometry. electrophoresis and electrochemistry
| Autoři | |
|---|---|
| Rok publikování | 2003 |
| Druh | Článek ve sborníku |
| Konference | Sborník příspěvků, VII. Pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Obor | Analytická chemie, separace |
| Klíčová slova | spectrophotometry;UV-Vis spectra;electrophoresis;PAA gel;electrochemistry;DPV and CPSA;proteins;detection limit |
| Popis | Pro kvantitativní stanovení proteinů existuje řada metod, při jejichž výběru se řídíme těmito hlavními kritérii: (a) množstvím proteinu dostupného pro analýzu, (b) koncentrací proteinu ve vzorku, (c) specifičností analýzy a (d) snadností a spolehlivostí dané metody. Některé běžně používané a snadno realizovatelné metody vyžadují jednoduchou instrumentaci a přitom jsou vysoce citlivé. Mezi takové metody patří detekce proteinu na polyakrylamidových gelech, vhodná zvláště pro purifikované proteiny. Pro stanovení proteinů v roztoku jsou vhodné i spektrofotometrické metody založené na absorpci záření v UV-Vis oblasti. Jednou z alternativních metod splňující jednoduchou instrumentaci a relativně vysokou citlivost je elektrochemie, jako např. diferenční pulzní voltammetrie - DPV a chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza - CPSA. Modelovými proteiny pro porovnání spektrofotometrických, elektroforetických a elektrochemických měření byly hovězí albumin (bovine serum albumin - BSA, Mr 67 kDa) a tumorový supresorový protein p53 (Mr 43 kDa). Spektrální měření byla uskutečněna na spektrofotometru Hewlett Packard, polyakrylamidovová gelová elektroforéza na elektroforetickém zařízení Biorad a elektrochemická měření na analyzátoru AUTOLAB (EcoChemie, The Netherlands) ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Zurich, Switzerland). Zatímco pro stanovení koncentrace obou proteinů při 276 nm bylo využita absorpce tryptofanu, pro spektrální analýzu kolorimetricky při 595 nm bylo využito Bradfordova barvení. V případě elektroforézy byl gel barven stříbrem nebo Coomassie Brilliant Blue. Elektrochemicky byly koncentrace stanoveny metodami DPV a CPSA. Z porovnání výsledků získaných výše uvedenými metodami vyplývá, že spektrofotometrie umožňuje stanovit koncentrace proteinů v jednotkách mikrogramů/mL a elektroforéza v jednotkách nanogramů/mL. I když je kvantifikace proteinů pomocí elektrochemie srovnatelná s těmito dvěma detekčními limity, DPV a CPSA ve spojení s adsorptivním strippingem umožňují stanovení proteinů ve velmi malých objemech zkoumaného roztoku (jednotky mL). |
| Související projekty: |