Quantification of proteins by means of spectrophotometry. electrophoresis and electrochemistry

Varování

Publikace nespadá pod Pedagogickou fakultu, ale pod Přírodovědeckou fakultu. Oficiální stránka publikace je na webu muni.cz.
Autoři

KIZEK René VACEK Jan BRÁZDOVÁ Marie TRNKOVÁ Libuše

Rok publikování 2003
Druh Článek ve sborníku
Konference Sborník příspěvků, VII. Pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů
Fakulta / Pracoviště MU

Přírodovědecká fakulta

Citace
Obor Analytická chemie, separace
Klíčová slova spectrophotometry;UV-Vis spectra;electrophoresis;PAA gel;electrochemistry;DPV and CPSA;proteins;detection limit
Popis Pro kvantitativní stanovení proteinů existuje řada metod, při jejichž výběru se řídíme těmito hlavními kritérii: (a) množstvím proteinu dostupného pro analýzu, (b) koncentrací proteinu ve vzorku, (c) specifičností analýzy a (d) snadností a spolehlivostí dané metody. Některé běžně používané a snadno realizovatelné metody vyžadují jednoduchou instrumentaci a přitom jsou vysoce citlivé. Mezi takové metody patří detekce proteinu na polyakrylamidových gelech, vhodná zvláště pro purifikované proteiny. Pro stanovení proteinů v roztoku jsou vhodné i spektrofotometrické metody založené na absorpci záření v UV-Vis oblasti. Jednou z alternativních metod splňující jednoduchou instrumentaci a relativně vysokou citlivost je elektrochemie, jako např. diferenční pulzní voltammetrie - DPV a chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza - CPSA. Modelovými proteiny pro porovnání spektrofotometrických, elektroforetických a elektrochemických měření byly hovězí albumin (bovine serum albumin - BSA, Mr 67 kDa) a tumorový supresorový protein p53 (Mr 43 kDa). Spektrální měření byla uskutečněna na spektrofotometru Hewlett Packard, polyakrylamidovová gelová elektroforéza na elektroforetickém zařízení Biorad a elektrochemická měření na analyzátoru AUTOLAB (EcoChemie, The Netherlands) ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Zurich, Switzerland). Zatímco pro stanovení koncentrace obou proteinů při 276 nm bylo využita absorpce tryptofanu, pro spektrální analýzu kolorimetricky při 595 nm bylo využito Bradfordova barvení. V případě elektroforézy byl gel barven stříbrem nebo Coomassie Brilliant Blue. Elektrochemicky byly koncentrace stanoveny metodami DPV a CPSA. Z porovnání výsledků získaných výše uvedenými metodami vyplývá, že spektrofotometrie umožňuje stanovit koncentrace proteinů v jednotkách mikrogramů/mL a elektroforéza v jednotkách nanogramů/mL. I když je kvantifikace proteinů pomocí elektrochemie srovnatelná s těmito dvěma detekčními limity, DPV a CPSA ve spojení s adsorptivním strippingem umožňují stanovení proteinů ve velmi malých objemech zkoumaného roztoku (jednotky mL).
Související projekty:

Používáte starou verzi internetového prohlížeče. Doporučujeme aktualizovat Váš prohlížeč na nejnovější verzi.