Výhody a úskalí produkce proteinů v expresním systému kvasinky Pichia pastoris

Logo poskytovatele

Varování

Publikace nespadá pod Pedagogickou fakultu, ale pod Přírodovědeckou fakultu. Oficiální stránka publikace je na webu muni.cz.
Autoři

LOCHMAN Jan KAŠPAROVSKÝ Tomáš MIKEŠ Vladimír

Rok publikování 2006
Druh Konferenční abstrakty
Fakulta / Pracoviště MU

Přírodovědecká fakulta

Citace
Popis Během posledních desetiletí byla vyvinuta celá řada technik pro manipulaci s DNA týkajících se její identifikace, specifického štěpení a klonování genů do celé rady organismů, které jsou po genetické stránce velmi odlišné od původního organismu. Hlavním úkolem takto vzniklých organismů je často snadná a finančně ne-příliš nákladná produkce proteinu. U celé řady proteinů byla za „továrnu“ pro výrobu proteinů zvolená bakterie E. coli a to především díky jejímu rychlému růstu, snadnému klonování cílových genů a rychlé izolaci vzniklého proteinu. Na druhé straně je však E. coli prokaryotní organismus, který postrádá intracelulární organely jako je endoplazmatické retikulum nebo Golgiho aparát zodpovědné v eukaryotních organismech za modifikaci a správnou konformaci vzniklého proteinu. I přes tyto nevýhody může být mnoho eukaryotních proteinů produkováno v bakterii E. coli, avšak rovněž celá řada produkovaných proteinů je nefunkčních a těžko exprimovatelných v solubilní formě. Právě tyto důvody vedly k vyvíjení eukaryotních produkčních systému, mezi něž patří kvasinka Pichia pastoris. Pichia pastoris je methanoltrofní kvasinka upravená pro produkci rekombinantních proteinů, které jsou klonovány za velmi silný promotor methanol-indukované alkohol oxidázy (AOX1) vložený do expresních vektorů. Syntéza proteinu je tedy spouštěna přidáním methanolu do média, které neobsahuje zdroj uhlíku a tvoří tak jediný zdroj uhlíku pro kvasinku. Této skutečnosti se dá dále využít pro produkci proteinů 100% značených uhlíkem 13C, jejichž struktura se dá poté určit pomocí techniky NMR (Nukleárně Magnetická Rezonance). Syntetizované proteiny mohou být dále sekretovány do média, což umožňuje využití technik fermentace a velmi snadnou purifikaci vzniklého proteinu. V neposlední řadě je výhodou i možnost produkce celé řady proteinů, které jsou toxické pro bakteriální buňku a nemohou být tedy exprimovány v bakterii E. coli. Naše zkušenosti s produkcí proteinů pomocí kvasinky Pichia pastoris jsou demonstrovány na syntéze mutantních forem proteinu cryptogeinu pocházejícího z houby Phytophtora cryptogea a je ukázána možnost snadné purifikace pomocí kombinace iontové výměnné kapalinové chromatografie a vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi.
Související projekty:

Používáte starou verzi internetového prohlížeče. Doporučujeme aktualizovat Váš prohlížeč na nejnovější verzi.