Random mutagenesis of lectins and high-throughput screening of mutant libraries
| Název česky | Náhodná mutageneze lektinů a high-throughput screening knihoven mutantů |
|---|---|
| Autoři | |
| Rok publikování | 2011 |
| Druh | Konferenční abstrakty |
| Fakulta / Pracoviště MU | |
| Citace | |
| Popis | Náhodná mutageneze je často využívána v proteinovém inženýrství k produkci proteinů s pozměněnými nebo vylepšenými vlastnostmi. Náhodná mutageneze zahrnuje mnoho metod, které jsou používány k produkci rozmanitých knihoven mutantů a ke screeningu těchtno knihoven. V této práci jsou aplikovány dva metodické směry. Error-prone PCR je založena na DNA polymerase náchylné k chybám, která zavádí nukleotidové změny během prodlužování amplifikované DNA. Mutační reakční podmínky mohou napomáhat vyššímu počtu náhodných substitucí. Cíleně-náhodná mutageneze je prováděna pomocí směsi speciálních oligonukleotidových primerů. které nesou náhodné substituce bazí na vybraném místě. Efektivní high-throughput screening je nezbytný, protože technikami náhodné mutageneze jsou produkovány rozsáhlé knihovny mutantů. V současné době jsou optimalizovány metody high-throughput screeningu, aby byla maximalizována automatizace tohoto procesu. Bylo aplikováno několik postupů ke zjednodušení směsi proteinů pro vazebné studie. Ke genu zájmu byla přidána signální sekvence pro expresi do periplasmy a byla provedena kultivace buněčné kultury v přítomnosti glycinu pro sekreci do media. Na N-konec proteinů byla přidána oligohistidinová kotva a byla testována chelatační chromatografie v minicentrifugačních kolonkách. Díky dobré termostabilitě cílových proteinů bylo možno zoptimalizovat teplotní přečištění hrubých buněčných lyzátů. LecB, gen kódující PA-IIL lektin z bakterie P. aeruginosa byl vybrán jako primární cílový gen pro modifikaci pomocí náhodné mutageneze. Tento rozpustný protein je velmi dobře charakterizovaný a vykazuje vysokou afinitu pro L-fukosu, ale dokáže také vázat několik monosacharidů s podobnou stereochemií. Cílem této práce je připravit mutanty se zajímavě pozměněnou specifitou a/nebo afinitou pro monosacharidy. Mutované lektiny s vylepšenými vlastnostmi mohou být později využity v biotechnologii a pro bioanalytické účely. |
| Související projekty: |